آخرین اخبار

چالش‌های نسل بعدی توالی‌سنجی؛ رشد با وجود افت و خیزهای فراوان

نوشته شده توسط تیم رصد علمنا

به گزارش پایگاه خبری علمنا،در این نوشتار، چالش‌های بحث توالی‌سنجی برای نام‌های تجاری برتر این حوزه بررسی می‌شود. طی ۱۰ سال گذشته، فناوری توالی‌سنجی نسل بعدی (NGS) با وجود مشکلات، به رشد خود ادامه داده است و خروجی‌های این فناوری افزایش و هزینه‌ها به میزان زیادی، کاهش یافته‌اند.
بیش از ده هزار دستگاه توالی‌سنجی نسل بعدی در سراسر جهان نصب شده است و اکنون ما با تناقضی در رابطه با معنای «بعدی» مواجهیم؛ نسل حاضر و نسل بعدی یکی هستند. «بعدی» در زمینه‌ توالی‌سنجی، حقیقتاً معنای خود را از دست داده است. بنابراین می‌توان پذیرفت توالی‌سنجی نسل بعدی در حال حاضر صرفاً همان «توالی‌سنجی» است.
طی دو سال اخیر، زمینه‌ اصلی فعالیت شرکت‌های مختلف، بهبود سهولت استفاده‌ از دستگاه بوده است. سیستم‌های رومیزی جدید شرکت ایلومینا مانند NextSeq، MiSeq و MiniSeq هر سه با «کارتریج معرف» کار می‌کنند، به این ترتیب تعداد دست‌ورزی‌ها و زمان آن‌ها کاهش یافته است.
کار با سیستم‌های Ion Torrent از کمپانی Thermo Fisher Scientific همواره نسبت به محصولات ایلومینا سخت‌تر بوده‌، با این حال، جدیدترین سیستم این کمپانی یعنی Ion S5 اختصاصاً به نحوی مهندسی شده است که روند کار از آماده‌سازی کتابخانه تا تولید داده ساده باشد.
پیشرفت‌های چشمگیر NGS در میزان خروجی، هزینه و کاربری، این امر را در ذهن برای ناظر ناآگاه متبادر می‌کند که قسمت سخت کار انجام شده است و دیگر مانعی در مسیر پیشرفت وجود ندارد؛ اما کار تازه شروع شده و چالش‌های بسیاری پابرجاست.
یکی از اولین مشکلات که بیشتر از همه فراموش می‌شود، کیفیت نمونه است. کار با نمونه‌هایی که محققان در دنیای واقعی با آن‌ها سر و کار دارند، چالش بیشتری نسبت به نمونه‌های تست استاندارد شرکت‌ها دارند.
برای توالی‌سنجی ژنوم انسان، یکی از محبوب‌ترین انواع نمونه‌ها، مورد “جاسازی شده در پارافین و تثبیت شده به کمک فرمالین” FFPE (Formalin-fixed paraffin-embedded) است. FFPE به دلایل مختلفی موردپسند است، یکی از مهم‌ترین آن‌ها فراوانی غالب این نوع از نمونه‌ها است. طبق یک تخمین انجام گرفته، بیش از یک میلیارد نمونه FFPE در سراسر جهان آرشیو شده است. علاوه بر این، نمونه‌های FFPE معمولاً حاوی اطلاعات فنوتیپی فوق‌العاده کاربردی هستند.
مشکل نمونه‌های FFPE این است که هم فرآیند تثبیت و هم شرایط نگهداری آن‌ها ممکن است به دی‌ان‌ای آسیب وارد کند. میزان و انواع مختلف این آسیب‌ها اگر در نظر گرفته نشود، ممکن است بر نتایج نهایی تأثیر منفی بگذارد.
تهیه‌ کتابخانه
اگرچه کمپانی‌های توسعه‌دهنده‌ NGS سال‌ها بر کاهش هزینه‌ تولید توالی خام وقت گذاشته‌اند؛ اما این وضعیت در مورد تهیه‌ و آماده‌سازی کتابخانه صادق نبوده ‌است. تهیه کتابخانه برای توالی‌سنجی کل ژنوم انسان، برای هر نمونه ۵۰ دلار هزینه دارد که هنوز، بطور نسبی بخش کوچکی از هزینه کل را شامل می‌شود. اما برای کاربردهای دیگر، مانند توالی‌سنجی ژنوم باکتری یا توالی‌سنجی آران‌ای با عمق کم (RNA-seq)، می‌تواند بخش عمده‌ هزینه‌ها را دربر گیرد.
گروه‌های متعددی بر روی پیدا کردن راه حلی برای کاهش هزینه‌ها در حال کار هستند، ولی هنوز در سطح تجاری پیشرفتی حاصل نشده است. با این حال نقطه‌ای‌ روشن در این بین، گسترش راه حل‌های توالی‌سنجی تک‌سلول مانند سیستم کرومیوم از کمپانی ۱۰X Genomics است، که در آن از سیستمی بر پایه‌ گوی‌های کوچک برای پردازش صدها تا هزاران نمونه بطور موازی استفاده می‌شود.
خوانش‌های کوتاه در مقابل خوانش‌های بلند
غلبه ایلومینا بر بازار توالی‌سنجی باعث شده‌است که اکثر داده‌های موجود بر اساس خوانش‌های کوتاه ایجاد شده باشد. داشتن تعداد زیادی خوانش کوتاه برای کاربردهای خاصی مناسب است، مانند تشخیص چندشکلی تک نوکلئوتیدی در دی‌ان‌ا‌‌ی ژنومی و شمارش رونوشت‌های آران‌ای. با این وجود، خوانش‌های کوتاه به تنهایی برای تعدادی از کارکردها ناکارآمد هستند، مانند خوانش مناطق پر تکرار ژنوم و تعیین ساختارهای پهن دامنه.
دستگاه‌های با خوانش بلند مانند RSII و Sequel از شرکت Pacific Biosciences و MinION از شرکت Oxford Nanopore Technologies به طور معمول قادر به ایجاد خوانش‌های ۱۵-۲۰ کیلوبازی هستند که مورد رضایت بسیاری از محققان واقع شده است.
برای بهره‌وری حداکثری از این دستگاه‌های بلند‌خوان، نیاز است که از روش جدیدی برای تهیه‌ نمونه‌های دی‌ان‌ای استفاده شود. روش‌های استاندارد زیست‌شناسی مولکولی برای جداسازی قطعات دی‌ان‌ای خیلی بلند بهینه نشده‌اند، بنابراین در این موارد باید تمهیدات خاصی دیده شود.
برای مثال برخی کمپانی‌ها کیت‌های خاصِ «وزن مولکولی بالا» ساخته‌اند که قادر به جداسازی قطعات بالای ۱۰۰ کیلوباز هستند.
به‌عنوان جایگزینی برای فناوری‌های بلندخوان، برخی کمپانی‌ها مانند ۱۰X Genomics در حال روی آوردن به فرمی از خوانش‌های کوتاه به نام خوانش‌های مرتبط (linked-reads) هستند. خوانش‌های مرتبط با اضافه کردن بارکدی خاص به هر خوانش کوتاه ایجاد می‌شوند. این بارکدهای یکتا برای چسباندن خوانش‌های کوتاه به همدیگر در فرآیند آنالیز استفاده می‌شوند. این تکنیک اطلاعات ژنومی در گستره‌ بزرگی ایجاد می‌کند که به ساخت بلوک‌های هاپلوتایپ و تبیین داده‌های ساختاری پیچیده کمک می‌کند.
مشکل دیگری که پژوهشگران با آن مواجه هستند، حجم زیاد داده است. فایل BAM (یک فایل نیمه فشرده‌ی هم‌ترازسازی) برای یک نمونه‌ کل ژنوم انسان ۳۰X نزدیک ۹۰ گیگابایت است. یعنی یک پروژه‌ی معمولی ۱۰۰ نمونه‌ای ۹ ترابایت فایل BAM تولید می‌کند.
با یک دستگاه ایلومینای HiSeq X که قادر به تولید بیش از ۱۳۰ ترابایت داده در سال است، ذخیره‌سازی این داده کم کم به یک نگرانی تبدیل می‌شود. برای مثال موسسه‌ی Broad با نرخ هر ۱۲ دقیقه یک ژنوم ۳۰X، داده تولید می‌کند که نزدیک ۴۰۰۰ ترابایت فایل BAM در سال می‌شود.
فایل‌های BAM می‌توانند به فایل VCF تبدیل شوند که شامل اطلاعات بازهایی است که با توالی مرجع متفاوت هستند. هرچند فایل VCF بسیار کوچکتر و کار با آن راحت‌تر است، هنوز این نیاز وجود دارد که فایل داده خام نگهداری شود، چون ممکن است پژوهشگر بخواهد داده‌ها را در آینده بازپردازش کند.
در نهایت، برای نمونه‌های درمانی، چالش‌هایی در زمینه‌ی تفسیر درست و قابل اتکای تفاوت توالی باقی می‌ماند. یک اگزوم به طور معمول بین ۱۰ هزار تا ۲۰ هزار شکل مختلف دارد، در حالی‌که نمونه‌ای از کل ژنوم عموماً بیش از ۳ میلیون شکل متفاوت نشان می‌دهد. برای کنترل بهتر، این اشکال بر اساس احتمال بیماری‌زایی آن‌ها فیلتر می‌شوند.
برای کمک به پزشکان، کالج ژنومیکس و ژنتیک پزشکی آمریکا، سازمان پاتولوژی مولکولی و کالج پاتولوژیست‌های آمریکا سیستمی برای طبقه‌بندی این اَشکال ساخته‌اند. دسته‌بندی‌های مختلف عبارت‌اند از: بیماری‌زا، احتمالاً بیماری‌زا، تأثیر احتمالی ولی با اطمینان کم، احتمالاً خوش‌خیم و خوش خیم.
اما این‌گونه طرح‌ها هم محدودیت‌های خاص خود را دارند. حتی اگر یک طبقه‌بندی مشخص برای داده‌های یکسان انجام گیرد، گروه‌های مختلف احتمالاً به تفاسیر گوناگونی می‌رسند. در چنین مواقعی تأمین هزینه‌ انجام دوباره کار برای آزمایشگاه تقریباً غیرممکن است.
علی‌رغم پیشرفت‌های فراوان توالی‌سنجی نسل بعدی در دهه‌های اخیر، هنوز چالش‌های بسیاری از تهیه نمونه گرفته تا آنالیز داده وجود دارد؛ و همانطور که پیشرفت‌های جدید حاصل می‌شوند، چالش‌های جدیدی نیز رخ می‌نمایند. بر طرف کردن این چالش‌ها برای گسترش فناوری‌های ژنومی و افزایش تأثیر آن بر سلامت بشر ضروری است.

درباره نویسنده

تیم رصد علمنا

دیدگاه شما چیست